实验准备
RNA酶 (RNase) 是导致RNA降解最主要因素，其自身非常稳定，仅在一些极端的条件下可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规的高温高压蒸汽灭菌法、蛋白酶抑制剂时常不能有效抑制RNase活性。RNase广泛存在于人的皮肤表面，对操作有严格要求。
1. 制备RNA过程中必须戴手套、口罩，使用专用超净工作台。
2. 移液器一般情况下采用以DEPC-H2O配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部，可基本达到要求。
3. 使用无RNase的实验器材：枪头、塑料制品和玻璃制品可以用0.1% DEPC (焦碳酸二乙酯) 水溶液处理过夜，然后在121 °C下高压湿热灭菌30 min以去除残留的DEPC，烘干备用。玻璃制品及金属器械可用干热灭菌去除RNase (160-170 °C烘烤2hrs以上)。
4.配制溶液应使用DEPC-H2O (DEPC-H2O的配制方法：ddH2O加入DEPC至终浓度0.1% (V/V)，放置过夜，然后在120 °C下高压湿热灭菌30 min，冷却后备用)。
5.整个实验过程中使用的试剂，实验器材和DEPC-H2O应专用，避免交叉污染。
表1.各种样品的最大使用量 (1 mL RISO)：
表2.大量组织RNA抽提使用量：
*当组织重量达到5 g时，按每克组织加入2 mL RISO计算。 操作步骤：
用户自备试剂：DEPC-H2O、氯仿、异丙醇、70%乙醇(DEPC-H2O配制)。
注意：①如果组织量(1-10 mg)或细胞数很少(102-104)，在样品中加入800 μL的RISO，用枪头反复抽吸混匀，可再加入糖原 (终浓度为250 μg/ml)，以提高RNA的产率，糖原 (低于4 mg/ml) 的存在，不影响cDNA第一链的合成,也不影响PCR。剧烈振荡或用匀浆器匀浆。②组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织剪碎，然后再充分匀浆。
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1. 样品处理：
(1) 贴壁培养细胞：
① 倒净培养液；② 每10 cm2生长的培养细胞中加入1 mL RISO试剂，在室温下水平放置5min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后吹打细胞使细胞脱落；③ 将细胞裂解液转移至离心管中，并用1 mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
(2) 悬浮培养细胞：
① 直接离心收集细胞，倒净培养液；② 细胞沉淀中每5-10× 106细胞加入1 mL RISO试剂；③ 将细胞裂解液转移至离心管中，用1 mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
(3) 动、植物及其它组织材料：
① 将组织在液氮中或与干冰共同磨碎成粉末状 (应无明显颗粒)；② 每50-100 mg的组织加1 mL RISO试剂 (大于200 mg的组织按表2加入相应体积的RISO)，样品的体积不应超过RISO试剂体积的10%，用匀浆器进行匀浆，至匀浆液呈无颗粒状；③ 将裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；④ 12,000g，4°C离心10 min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中。
2. 向上述步骤(1.)得到的匀浆液中加入0.2 mL氯仿 (每使用1 mL RISO加0.2 mL氯仿)，盖紧管盖，用手上下振荡15 sec，得浑浊液，无分层现象，室温静置2-3 min。
3. 12,000 g，4°C离心15 min。离心后，样品分为三层：无色上清水相、中间蛋白层及下层有机相，水相的体积约为所用RISO试剂的60%。
4. 小心吸取无色上清液至另一离心管 (若需分离DNA和蛋白，则小心保留中间层和有机相)。
5. 加入0.5 mL异丙醇 (每使用1 mL RISO加0.5 mL异丙醇)，轻轻混匀，室温静置10 min。
6. 12,000 g，4°C离心10 min。
7. 弃去上清，加1 mL 70%乙醇 (每使用1 mL RISO试剂至少加1 mL 70%乙醇)，涡旋振荡混匀。
8. 7,500 g，4°C离心5 min。
9. 弃尽上清，超净工作台干燥沉淀或真空离心干燥 (不可太干，否则RNA将会难以溶解)，加入适量DEPC-H2O溶解RNA沉淀 (可在55-60°C促溶10 min)。
10. RNA的分析和定量：
(1)用分光光度计测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。OD260/280在1.8-2.1视为抽提的RNA的纯度很高。
(2)进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。
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RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，但是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率与分子量成正比。
判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。在有EB存在时，完整未降解的RNA制品电泳图谱应可清晰看到18S rRNA、28S rRNA两条带，也应当能看到一条由tRNA、5.8S rRNA和5S rRNA组成的、较模糊迁移较快的条带，且28S rRNA条带亮度应为18S rRNA的1.5-2倍。 |
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注意事项
本试剂含强变性剂，应避免与皮肤接触，如接触皮肤，应立即用大量的水冲洗，严重者到医院处理。本品含有酚类，具有特殊气味，请于取用试剂溶液后马上盖好瓶盖，或于通风橱中操作。
常见问题分析
1、通常情况下每毫克组织或1×106个细胞预期提取RNA量：
2、常见问题及解决方案： |
